تجزیه و تحلیل شبکه فیلوژنتیک ژنوم SARS-CoV-2

در یک تجزیه و تحلیل شبکه فیلوژنتیک از 160 ژنوم کامل سندرم تنفسی حاد انسانی ، ژنوم کروناویروس 2 (SARS-Cov-2) ، ما سه نوع مرکزی را می یابیم که با تغییر اسیدهای آمینه ، که ما آنها را B ،A و C نامگذاری کرده ایم از یکدیگر متمایز می شوند. نوعA همان نوع اجدادی از گروه کروناویروس منشا گرفته از خفاش است. انواع A و C به نسبت قابل توجهی در خارج از آسیای شرقی یافت می شود ، یعنی در اروپایی ها و آمریکایی ها. در مقابل ، نوع B متداولترین نوع در آسیای شرقی است و به نظر می رسد ژنوم اجدادی آن در خارج از آسیای شرقی گسترش نیافته مگر در صورت تبدیل به مشتقات نوع B و این امر به اثرات بنیانگذار یا مقاومت ایمنی یا محیطی در برابر این نوع در خارج از آسیا اشاره دارد. این شبکه به درستی مسیرهای عفونت را برای موارد بیماری کرونا ویروس 2019 (COVID-19) ردیابی می کند و نشان می دهد که شبکه های فیلوژنتیک نیز به طور مشابه می توانند برای کمک به ردیابی منابع عفونت COVID-19 ثبت نشده ، که می توانند منجر به شیوع مکرر بیماری استفاده شوند ، مورد استفاده قرار بگیرند.

در ابتدا به نظر می رسید که جستجوی ریشه های انسانی ، با انتشار درخت DNA جهانی میتوکندری انسانی گامی به جلو برداشته باشد. با این حال به زودی معلوم شد که روش درختی، تفسیر داده های مبهم را تسهیل نمی کند. این انگیزه منجر به توسعه روش های شبکه فیلوژنتیک که قادر به تجسم تعداد زیادی از درختان بهینه هستند، در اوایل دهه ۱۹۹۰ شد. این رویکرد شبکه ، براساس داده های میتوکندریایی کروموزومی Y ، به ما اجازه می دهد جنبش های جمعیت ماقبل تاریخ که این سیاره را شکل داد بازسازی کنیم. رویکرد شبکه فیلوژنتیک از سال 2003 به بعد کاربردی در بازسازی زبان ماقبل تاریخ یافت. اکنون زمان آن فرا رسیده که از روش شبکه فیلوژنتیک در تحلیل داده های ویرولوژی استفاده شود تا به درک تکامل کروناویروس کمک کند.

در اوایل مارس 2020 ، پایگاه داده GISAID مجموعه ای حاوی 253 ژنوم کامل و ناقص سندرم حاد تنفسی حاد coronavirus 2 که با کمک پزشکان و محققان از سراسر جهان از دسامبر سال 2019 شروع به ذخیره سازی شده بود، گردآوری کرد. برای درک تکامل این ویروس در انسان و کمک به ردیابی مسیرهای عفونت و طراحی استراتژی های پیشگیری ، ما در اینجا یک شبکه فیلوژنتیک از 160 ژنوم کامل SARS-Cov-2 را ارائه می دهیم.

ژو و همكاران به تازگی گزارش داده اند كروناویروس خفاش تشابه توالی 96.2٪ به ویروس انسانی کرونا دارد. ما از این ویروس خفاش به عنوان یک گروه خروجی استفاده می کنیم ، در نتیجه ریشه شبکه در یک خوشه از دودمان قرار می گیرد که ما آن را A لقب داده ایم. به طور کلی ، شبکه ، همانطور که در یک شیوع مداوم انتظار می رود ، ژنوم ویروسی اجدادی موجود در کنار ژنوم دختر تازه جهش یافته آنها را نشان می دهد.

دو زیر گروه A وجود دارد که با جهش مترادف T29095C متمایز می شوند. در زیر شاخه T آلل ، چهار فرد چینی (از استان ساحلی جنوبی گوانگدونگ) ژنوم اجدادی را در بدنشان حمل می کنند ، در حالی که سه بیمار ژاپنی و دو بیمار آمریکایی با تعدادی جهش با آنها تفاوت دارند. گزارش شده است كه این بیماران آمریكایی در نزدیکی منبع احتمالی شیوع بیماری در ووهان سابقه اسکان داشتند.زیر شاخه الل C، دارای شاخه های جهشی نسبتاً طویلی است و شامل پنج فرد از ووهان است که دو نفر از آنها در گره اجدادی و هشت نفراهل آسیای شرقی یعنی از چین و کشورهای مجاور حضور دارند. قابل توجه است که تقریبا نیمی از (15/33) انواع موجود در این کلانشهر ، در خارج از آسیای شرقی ، عمدتاً در ایالات متحده و استرالیا یافت می شود.

دو گره شبکه مشتق شده از نظر تعداد افراد موجود در نوع گره و در شاخه های جهش یافته از این گره ها قابل توجه است. ما این خوشه های فیلوژنتیکی را B و C نامیده ایم.

برای نوع B ، همه به جز 19 مورد از ۹۳ ژنوم نوع B در ووهان (22 نفر) و در سایر مناطق شرق چین (31 نفر) و به طور پراکنده در کشورهای مجاور آسیا (21 نفر) نمونه برداری شد. در خارج از آسیای شرقی ، 10 نوع B در ژنوم ویروسی از ایالات متحده و کانادا ، یکی در مکزیک ، چهار در فرانسه ، دو در آلمان و دیگری در ایتالیا و استرالیا یافت شد. گره B با دو جهش از A حاصل می شود: جهش مترادف T8782C و جهش ناشناس C28144T که یک لوسین را به سرین تغییر می دهد. خوشه B با توجه به طول شاخه های جهش قابل توجه است: در حالی که نوع اجدادی B توسط انحصار آسیای شرقی(ژنوم 26/26) تکثیر می شود ، هر ژنوم نوع(19/19) B در خارج از آسیا جهش یافته است. به نظر نمی رسد که این پدیده به دلیل تاخیر یک ماهه و میزان جهش همزمان بر روی ژنوم ویروسی قبل از گسترش در خارج از چین باشد (Dataset S1 ، جدول تکمیلی 2). یک سناریوی بنیانگذار پیچیده یکی از احتمالات است ، و توضیح دیگری که باید در نظر گرفته شود این است که ویروس اجدادی نوع ووهان B از نظر سیستم ایمنی یا محیطی با بخش بزرگی از جمعیت شرق آسیا سازگار است و ممکن است برای غلبه بر مقاومت در خارج از شرق آسیا نیاز به جهش داشته باشد.

نوع C با نوع والد B خود با جهش ناشناس G26144T متفاوت است که یک گلیسین را به یک والین تغییر می دهد. در مجموعه داده ، این نوع اصلی اروپایی است (تعداد = 11) ، با نمونه های مشابهی در فرانسه ، ایتالیا ، سوئد و انگلیس و در کالیفرنیا و برزیل. این نمونه در سرزمین اصلی چین وجود ندارد ، اما در سنگاپور مشهود است (5 نفر) و همچنین در هنگ کنگ ، تایوان و کره جنوبی یافت می شود.

یکی از کاربردهای شبکه فیلوژنتیک ، بازسازی مسیرهای عفونت در جاهای ناشناخته هستند که برای سلامت عمومی مخاطه آمیزند. موارد زیر که در آنها رد عفونت به خوبی ثبت شده ممکن است به عنوان مدرک مصور کارا باشد (ضمیمه SI). در 25 فوریه 2020 ، نخستین بیمار برزیلی گزارش شد که به دنبال بازدید از ایتالیا آلوده شده بود ، و الگوریتم شبکه این مساله را با پیوند جهش یافته بین یک ژنوم ایتالیایی و ژنوم ویروسی برزیلی وی در خوشه C منعکس می کند (SI ضمیمه ، شکل S1). در یک مورد دیگر ، مردی از اونتاریو از ووهان در مرکز چین به گوانگدونگ در جنوب چین سفر کرده بود و سپس به کانادا بازگشته بود ، جایی که وی بیمار شد و به طور قطعی در 27 ژانویه سال 2020 با بیماری کرونا ویروس 2019 (COVID-19) تشخیص داده شد. شبکه فیلوژنتیک (SI ضمیمه ، شکل S2) ، بازسازی ژنوم ویروس وی از یک گره اجدادی و در ترکیب انواع ویروس مشتق شده در فوشان و شنژن (هر دو در استان گوانگدونگ) ، مطابق با تاریخ سفر بیمار مذکور بود. ژنوم ویروس وی در حال حاضر با سایر موارد آمریکای شمالی آلوده (یکی کانادایی و دو کالیفرنیایی)مقایسه شده که واضح است یک تبارشناسی مشترک ویروسی مشترک وجود دارد. پرونده ژنوم ویروسی تک مکزیکی در شبکه یک عفونت مستند است که در 28 فوریه 2020 در یک مسافر مکزیکی به ایتالیا تشخیص داده شده است. این شبکه نه تنها منشاء ایتالیایی ویروس مکزیکی را تأیید می کند (SI ضمیمه ، شکل S3) ، بلکه همچنین دلالت بر این دارد که این ویروس ایتالیایی از اولین ویروس مستند آلمانی در 27 ژانویه سال 2020 در بدن یک کارمند که در شرکت Webasto در شهر مونیخ کار می کرد ناشی شده است. این بیمار آلمانی به نوبه خود ، ویروس را از یک همکار چینی در شانگهای که قبلا با والدین ووهانی خود ملاقات کرده گرفته بود. این سفر ویروسی از ووهان به مکزیک که یک ماه طول کشید، 10 جهش داشته که در شبکه فیلوژنتیک ثبت شده است.

این شبکه ویروسی ، تصویری از مراحل اولیه یک بیماری همه گیر قبل از اینکه فیلوژنی با مهاجرت و جهش بعدی پنهان شود ، است. ممکن است پرسیده شود که آیا با استفاده از قدیمی ترین ژنوم نمونه موجود به عنوان ریشه ، می توان ریشه تکامل ویروسی را در این مرحله بدست آورد. همانطور که SI ضمیمه ، شکل S4 نشان می دهد ، با این حال ، اولین ژنوم ویروس که در 24 دسامبر سال 2019 نمونه برداری شد ، از نظر ریشه با ریشه گروه خفاشی فاصله دارد. جهش های اصلی توصیف شده توسط انواع آزمایشگاه های مشترک و سیستم عامل توالی تأیید شده است و قابل اعتماد می باشد. الگوهای فیلوگرافی در شبکه به طور بالقوه تحت تأثیر تاریخ مهاجرت متمایز ، رویدادهای بنیانگذار و اندازه نمونه قرار می گیرد. با این وجود محتاطانه باید این احتمال را در نظر بگیریم که انواع جهش یافته ممکن است تظاهر بالینی و شیوع بیماری را تغییر دهند. طبقه بندی فیلوژنتیک ارائه شده در اینجا ممکن است مورد استفاده قرار گیرد تا هنگام ارزیابی نتایج بالینی و اپیدمیولوژیک عفونت SARS-CoV-2 ، و در هنگام طراحی درمان و درنهایت واکسن ، اینگونه اثرات را رد یا تأیید کند.

ابتکار جهانی در مورد به اشتراک گذاری داده های بیماری آنفلوانزای مرغی (GISAID) در سال 2006 تأسیس شد ، و از سال 2010 تحت میزبانی وزارت غذا ، کشاورزی و حمایت از مصرف کننده فدرال آلمان بوده است. GISAID همچنین از دسامبر سال 2019 به یک مخزن coronavirus تبدیل شده است. از تاریخ 4 مارس 2020 ، نقطه برش برای تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک ما ، پایگاه داده این سازمان ۲۵۴ ژنوم کرونا ویروس را جمع آوری کرده است : جدا شده از 244 انسان ، نه پنگولین چینی ، و یک خفاش Rhinolophus affinis (BatCoVRaTG13 از استان یوننان ، چین). توالی ها توسط 82 آزمایشگاه ذکر شده در Dataset S1 ، جدول تکمیلی آورده شده است. اگرچه SARS-CoV-2 یک ویروس RNA دار است ، توالی های رسوب کرده به روش معمولی در قالب DNA هستند. تراز اولیه ما گزارش قبلی ژو و همكاران را تأیید كرد که توالی pangolin coronavirus با توجه به ویروس SARS-CoV-2 انسانی ضعیف محافظت می شود ، در حالی که کرونا ویروس خفاش مثل عدد 96.2٪ منتشر شده توسط ژو و همکاران ، مشابهت دنباله ای از 96.2٪ به همراه داشت. ما توالی های جزئی را دور انداختیم و فقط کامل ترین ژنومها را که توسط وو و همکاران به ژنوم مرجع کامل تراز شده استفاده کردیم که شامل 29903 نوکلئوتید است. سرانجام ، برای اطمینان از مقایسه ، ما پله های همه دنباله ها را به دامنه اجماع 56 تا 29،797 ، با قرار دادن شماره نوکلئوتید مطابق توالی مرجع ووهان 1 کوتاه کردیم. كد هاي آزمايشگاهي 160 دنباله حاصل و توالي هاي تاج Coronavirus در Dataset S1 ، Table Supplement (برچسب هاي جدا شده Coronavirus) ذکر شده است.

160 توالی کروناویروس انسانی دقیقاً 100 نوع مختلف را شامل می شود. ما برای تعیین ریشه درون فیلوژنی به داده های آنتی بادی coronavirus، آن یک گروه کروناویرس خفاشی را اضافه کردیم. تجزیه و تحلیل شبکه فیلوژنتیک با بسته شبکه 5011CS انجام شد ، که شامل الگوریتم شبکه پیوستن به میانه و یک الگوریتم درخت اشتاینر برای شناسایی درختان خیلی ساده در شبکه های پیچیده است. ما شکافهای نوکلئوتیدهای مجاور را به عنوان رویدادهای حذف تنها کدگذاری کردیم (این حذف ها نادر است ، حداکثر 24 نوکلئوتید طولانی است و بیشتر در قاب خواندن اسید آمینه) و داده ها را با پارامتر epsilon تنظیم شده بر روی صفر قرار دادیم و یک آزمایش اکتشافی با برابر قرار دادن اپسیلون با عدد ۱۰ انجام دادیم. هر دو تنظیمات دارای شبکه پیچیدگی کم هستند. سپس الگوریتم درخت اشتاینر در هر دو شبکه اجرا شد و نتیجه یکسانی را ارائه داد که درختان پرکارترین درون شبکه از طول 229 جهش بودند. ساختار هر دو شبکه بسیار مشابه بود ، با تنظیم epsilon =10 یک مستطیل اضافی را بین خوشه های A و B رسم می کرد. خروجی شبکه با استفاده از گزینه Network Publisher برای نشان دادن مناطق جغرافیایی ، زمان جمع آوری نمونه ها و نامگذاری خوشه ها حاشیه نویسی شد.

توالی نوکلئوتیدی ژنومهای SARS-CoV-2 مورد استفاده در این تجزیه و تحلیل ، پس از ثبت نام رایگان ، از پایگاه داده GISAID یا (https://www.gisaid.org/) در دسترس است. بسته نرم افزاری Network5011 و پرونده های شبکه coronavirus در وب سایت فناوری فلاکسوس (https://www.fluxus-engineering.com در دسترس هستند.

این پژوهش‌ نحوه فراگیری COVID19 را همچون "انفجار ستاره ای پرجرم" ترسیم میکند که به واسطه جهش ژنتیکی از چین و آسیا تا استرالیا، اروپا و آمریکای شمالی گسترش پیدا کرده است. پژوهشگران عقیده دارند که متدهای آن‌ها کمک می‌کند منابع سرایت ثبت نشده این اتفاق شناسایی شوند. محققان دانشگاه کمبریج در انگلستان و آلمان با استفاده از تکنیک‌های شبکه‌ی ژنتیکی، مسیرهای تکاملی اولیه کووید-19 انسانی را در حالی که این بیماری عفونی از ووهان تا اروپا و آمریکا شیوع پیدا می‌کند دوباره‌سازی کرده‌اند.

پس از آنالیز اولین 160 ژنوم کامل ویروسی که از بیمار انسان گرفته شد و به ترتیب پشت سر هم قرار گرفت، دانشمندان توانستند منشا سرایت ویروس کورونای جدید را از طریق جهش‌های آن ترسیم کرده و به اجداد ویروسی متفاوتی دست پیدا کنند.

پیتر فراستر پزشک ژن‌شناس دانشگاه کمبریج می گوید: «جهش‌های سریع بسیار زیادی برای ردیابی منظم یک درخت خانوادگی COVID-19 وجود دارد. ما از یک الگوریتم شبکه‌ ریاضی برای تجسم همزمان تمام درخت‌های محتمل استفاده کردیم.»

اين تحقيق ٣ نوع "متفاوت" از COVID-19 را نشان داد كه شامل خوشه هایي با دودمان نزديك به هم هستند و آنها را "A", "B", "C" نام گذاری کردند . فورستر و همكارانش فهميدند كه نزديكترين نوع COVID-19 به نوع كشف شده در خفاشها-نوع"A" ،"ژنوم اصلي ويروس انسان"-در ووهان وجود داشته است ، اما در كمال تعجب و ناباوري نوع ويروس غالب شهر نبوده است.

آمريكايي هايي كه در ووهان زندگي مي كردند گزارش دادند كه نسخه هايي از "A" در افراد چيني ديده شده است.نسخه هاي جهش يافته "A" در بيماران ايالات متحده و استراليا نیز يافت شده است.

نوع B ویروس ( ویروس اصلی درگیر کننده شهر ووهان) در سراسر شرق آسیا شیوع پیدا کرده است. با این وجود محققان می گویند ، این نوع بدون جهش دیگری در منطقه گسترش یافته است که نشانگر وقوع یک رویداد بنیادین در ووهان یا مقاومت در برابر نوع ,B COVID-19 در خارج از آسیای شرقی دارد.

نوع "C" نوع عمده اروپایی است که در بیماران ابتدایی کشور های فرانسه ، ایتالیا ، سوئد و انگلیس یافت می شود. این نمونه درنمونه هایی که در سرزمین اصلی چین بوده وجود ندارد ، اما در سنگاپور ، هنگ کنگ و کره جنوبی دیده می شود .

تجزیه و تحلیل جدید همچنین حاکی از آن است که یکی از اولین دلایل ورود ویروس به ایتالیا از طریق اولین مورد آلوده آلمان که در تاریخ 27 ژانویه ثبت شده بود، انجام شد و یک مسیر دیگر درگیری ایتالیا مربوط به یک "خوشه سنگاپوری " بوده است .

نکته مهم این است که محققان می گویند که تکنیک های شبکه ژنتیکی آنها به طور دقیق مسیرهای شیوع ایجاد شده را ردیابی کرده : جهش ها و سلسله های ویروسی موجود در این شبکه مثل نقطه چین به یکدیگر وصل شدند و کمک به حصول این نقشه کردند .

هم چنين؛ دانشمندان بر اين باورند كه روش هاى فيلوژنيك (تبارزايشى) ميتواند در آخرين ژنوم ويروس كرونا به كار برد تا به پيش بينى کانون آينده انتقال ویروس در جهان شناسایی شود .

دکتر پیتر فارستر ،‌ عضو موسسه تحقیقات باستانی مکدونالدز و همین طور عضو انجمن آموزش مستمر دانشگاه کمبریج اضافه کرد :

"این پتانسیل وجود دارد که بآنالیز شبکه های فیلوژنتیک یه شناسایی منابع ثبت نشده شیوع COVID19 کمک شود ، با قرنطینه کردن این منابع میتوان از شیوع جهانی بیشتر جلوگیری کرد . "

دستیافته ها امروز در Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS) منتشر شده است . نرم افزاری که برای این پژوش و آنالیز بالغ بر ۱۰۰۰ ژنوم ویروس کرونا استفاده شده و هنوز هم استفاده می شود به صورت رایگان در وبسایت www.fluxus-technology.com. در دسترس است .

محققان نوع A را که بیشتر به نوع موجود در خفاش و پنگولین شباهت دارد ، که بعنوان ریشه ی شیوع معرفی کرده اند . نوع B با دو جهش از نوع A مشتق شده است . و همچنین نوع C دختر نوع B است .

محققان میگویند بومی شدن نوع B در شرق آسیا میتواند ناشی از اثر "بنیان گذار " باشد .

*اثر بنیان گذار :‌ نوعی تنگنای ژنتیکی که در مورد ویروس ها وقتی رخ میدهد که یک نوع جدید از یک گروه کوچک آلوده و ایزوله شده بوجود بیاید .

Forster معتقد است که توضیح دیگری برای این پدیده وجود دارد که قابل توجه است : "نوع B ویروس که در ووهان موجود است ممکن است بلحاظ ایمینی شناسی و محیطی به جمعیت زیادی از آسیای شرقی وفق پیدا کرده است . ویروس برای غلبه بر مقاومت موجود در خارج از آسیای شرقی نیاز به جهش ژنتیکی پیدا کند. به نظر میرسد که در این مرحله اولیه،ما نرخ جهش کند تری در شرق آسیا را شاهد هستیم."

وی افزود : شبکه مسریی که ما به صورت جزیی در آورده ایم ،یک تصویر سریع از مراحل ابتدایی اپیدمی ست . قبل از آنکه COVID19 توسط جهش های مکرر پیچیده شود . درست مانند گرفتن یک ابرنواختر در حال پخش.

از آنجا که مطالعه PNAS درزمان چاپ این مقاله انجام شده است ، تیم تحقیقاتی تحلیل خود را به ۱۰۰۱ ‍زنوم ویروسی گسترش دادند. این فرآیند هنوز در حال بررسی است، فورستر می‌گوید آخرین تلاش ها نشان می‌دهد که اولین عفونت در بین انسان‌ها بین اواسط ماه سپتامبر و اوایل دسامبر رخ داده‌است.

متد شبکه ی فیلوژنتیک که توسط محققان استفاده شده است و به آن ها امکان ساخت تجسم بصری با صد ها درخت تکاملی را در یک گراف داده است ، در سال ۱۹۷۹ در نیوزیلند آغاز شد و سپس در دهه ی ۹۰ توسط ریاضیدانان آلمانی گسترش پیدا کرد . این روش ها توجه پروفسور باستان شناس – کالین رنفرو – نویسنده مقاله جدید PNAS را در سال ۱۹۹۸ جلب کرد .رنفرو یکی از اولین گروه های پژوهشی باستان شناسی دنیا را در دانشگاه کمبریج پایه گذاری کرده است .